細(xì)胞凍存液操作步驟

（一）細(xì)胞凍存

1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗，去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長的細(xì)胞消化下來， 離心1000rpm，5min；

2.去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×106/ml～1×107/ml，將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

3.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者，凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（二） 細(xì)胞復(fù)蘇

1.從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化，從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；

2.離心， 1000rpm，5min；棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

3.次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

注意事項

1．從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液；

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷；

3．凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。

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