解析細(xì)胞凍存液和培養(yǎng)基的配制
1、準(zhǔn)備工作

（1）細(xì)胞培養(yǎng)基： 1L； ：L-15:500ml； 配置量： 配方 DMEM:350ml； Ham’s F12:150ml；NaHCO3：1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mgEGF:50μg滅活 FBS:50ml；雙抗：10ml

（2）冷凍保護(hù)液：配制量：40ml；配方：FBS:8ml；DMSO:3ml；培養(yǎng)基：29ml

2、細(xì)胞培養(yǎng)基配制方法 FBS*天準(zhǔn)備工作： 兩支， 提前一晚四度冰箱解凍； 烘干硅膠（用于第二天干燥盒干燥 insulin）

（1）細(xì)胞培養(yǎng)基配制準(zhǔn)備工作：1L 廣口瓶三個(gè)，提前高溫高壓滅菌（用于盛放培養(yǎng)基） ；1L 燒杯一個(gè)，三個(gè)，；50ml 離心管 22 支 ；

（2）取一包 Ham’s F12 干粉加入到 800LddH2O 中將溶液反復(fù)沖洗包裝內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中，使干粉充分溶解； 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到 1L 兩桶中， 取少量 ddH2O 潤(rùn)洗燒杯， 定容至 1000ml。同樣方法配制 L15 培養(yǎng)基和 DMEM 培養(yǎng)基。

（3）取 L-15:500ml；DMEM:350ml；Ham’s F12:150ml 加入到大燒杯中，配制成混合培養(yǎng)基。

（4） 取 NaHCO3： 稱(chēng) 1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mg全部溶于混合培養(yǎng)基， Insulin 放置于-20℃ 。冰箱中，置于室溫的時(shí)候冰晶解凍為水滴，影響胰島素稱(chēng)量精度，故需要放置到干燥盒中干燥 30min-60min； 稱(chēng)量裝置為精細(xì)天平， 打開(kāi)精細(xì)天平后， 打開(kāi)倉(cāng)門(mén)， 放置一張干凈稱(chēng)量紙，按 TARE 鍵清零。用擦凈的藥匙取極少量干粉，觀察示數(shù)，加至 0.0100g。小心取出稱(chēng)量紙，將干粉加入到培養(yǎng)基中， 用食指輕輕彈稱(chēng)量紙使剩余粉末進(jìn)入培養(yǎng)基， zui后用少量培養(yǎng)基溶液沖洗稱(chēng)量紙，保證所有 insulin 進(jìn)入培養(yǎng)基。

（5）利用 NaOH 溶液調(diào) PH 值至 7.5：用之前調(diào)好 PH 測(cè)量器，分別在 7.0、10.0、4.0 處調(diào)試PH，確定后測(cè)定 PH。

（6）加入雙抗溶液 10ml。

（7）在超凈臺(tái)上利用 0.2μm 濾膜過(guò)濾除菌（這步驟工作量較大，需要兩個(gè)同學(xué)完成） 。大概過(guò)濾 200ml 后濾膜會(huì)堵住，需要重新更換。

（8）FBS 滅活：提前約 15min 將水浴鍋打開(kāi)，溫度設(shè)置在 54℃（本實(shí)驗(yàn)室水浴鍋溫度通常高于實(shí)際溫度 2℃，實(shí)際溫度以溫度計(jì)為準(zhǔn)） 。用樣品袋包裝盛放 FBS 的 50ml 離心管，擠出空氣，放置在 56 攝氏度下滅活 30min。

（9）FBS 分裝：分裝到兩個(gè) 15ml 離心管和 20 個(gè) EP 管中，放置于-20℃冰箱中

（10）分裝：分裝到 50ml 離心管中，4℃保存。細(xì)胞培養(yǎng)基使用前加入 2.5mlFBS，250μlEGF溶液（EGF 溶液濃度為 10ng/μl）。

3、細(xì)胞凍存液配制：將 FBS:8ml；DMSO:3ml；培養(yǎng)基：29ml 加入到 50ml 離心管中，混勻。

（1）凍存前一天，更換培養(yǎng)基。

（2）吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用 0.05胰酶-EDTA 消化細(xì)胞（根據(jù)培養(yǎng)面積加入相應(yīng)胰酶試劑），5min，吹散細(xì)胞。

（3）加入與胰酶-EDTA 等量的培養(yǎng)基，終止消化；然后 1000rpm，離心 5min。

（4）去除上清，加入適量培養(yǎng)基（在 EP 管架上滑動(dòng)，使細(xì)胞分散，之后用槍頭輕柔吹打，使細(xì)胞*均勻懸?。?；進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞計(jì)數(shù)，取細(xì)胞計(jì)數(shù)器，每孔加 10μl 細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)區(qū)（中央 25 個(gè)格子） ，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，移動(dòng)計(jì)算下方計(jì)數(shù)區(qū)細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞總量計(jì)算公式，AB/2稀釋倍數(shù)106。AB 為上下兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)細(xì)胞總數(shù)。

（5）1000rpm 離心 5min。

（6）加入適量?jī)龃嬉海ㄔ?EP 管架上滑動(dòng)，使細(xì)胞分散，之后用槍頭輕柔吹打，使細(xì)胞*均勻懸?。辜?xì)胞zui終濃度達(dá)到 1-3106cell/ml。

（7）將細(xì)胞懸液加入到凍存管中，每管 1ml：凍存管提前用標(biāo)簽筆寫(xiě)入如下信息，細(xì)胞名稱(chēng)，傳代次數(shù)，細(xì)胞數(shù)量，凍存日期。

（8）取出凍存盆，在通風(fēng)櫥中向槽內(nèi)加入適量異丙醇（因?yàn)楫惐季哂形⒍拘裕?。將凍存管插入到凍存盆的凹槽中，放?80℃冰箱中過(guò)夜。

（9）第二天早上將凍存管轉(zhuǎn)至液氮中：用棉紗布包裹凍存管，用粗棉繩扎緊，打上標(biāo)簽，寫(xiě)上凍存日期，細(xì)胞種類(lèi)，傳代次數(shù)，細(xì)胞數(shù)量。