細胞凍存操作要點：

 

1、細胞凍存前12~24h，換新鮮培養(yǎng)基，使細胞一直處于對數生長期。

 

2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。

 

3、棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標記，標明細胞名稱、凍存日期等。（細胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：5：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：8：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據各實驗室實際條件調整）

 

4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內可直接放入-80℃過夜，再轉至液氮罐內。注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。

 

5、細胞凍存后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，再繼續(xù)凍存。

 

 

細胞復蘇操作要點：

 

1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

 

2、將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內*解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。

 

3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉移至離心管內。

 

4、800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

 

5、將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養(yǎng)。

 

6、第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

 

對DMSO不敏感的細胞在復蘇時也可不離心，減少操作步驟，也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉移至T25細胞瓶內，補加新鮮培養(yǎng)基，放入溫箱內培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基，移除死細胞。